Principais 

• Jared Padalecki como Sam Winchester: É o segundo filho de John e Mary Winchester. Quatro anos mais jovem do que seu irmão, Dean. Ele é diferente do seu irmão mais velho, na medida em que ele é sensível, racional, mais inocente, e aparentemente mais preocupado com uma "vida normal" do que seu irmão, a despeito de tudo isto, é evidente que ele iria fazer qualquer coisa por Dean. Ele também se rebelou contra seu pai.

• Jensen Ackles como Dean Winchester: Nascido em Lawrence, Kansas. É o filho de John e Mary Winchester e irmão mais velho de Sam. Desde que teve idade suficiente para usar uma arma, Dean foi treinado por seu pai para caçar “coisas” sobrenaturais, e apesar disso, tem medo de andar de avião. Suas paixões são: seu carro, mulheres e comer, além de fazer de tudo para proteger sua família,principalmente seu irmão,Sam. Com isso, já passou pelo inferno e pelo céu.

• Misha Collins como Castiel: É o anjo que resgatou Dean do inferno após a sua morte pelos cães do inferno de Lilith.Vem a terra instruir Dean e Sam quanto a uma missão da qual os irmãos são protagonistas. Mas pela proximidade humana que estabeleceu, principalmente com Dean, recebe ordens superiores para afastar-se emocionalmente dos humanos. Porém, Castiel não cumpre as ordens superiores e ainda acaba se rebelando contra o céu, por conta disso acabou se unindo aos irmãos Witchester e se tornando mais um personagem principal na luta contra o apocalipse.

Secundários 

Jim Beaver interpreta Bobby Singer.

• Jim Beaver como Bobby Singer: Era amigo de John, quando ele morre, Bobby toma conta de Dean e Sam. Além de ser experiente, Bobby é também muito inteligente. Ele sabe exatamente o que fazer quando alguma coisa dá errada, sabe examinar a situação e sabe administrar os seus dons e conhecimentos.É considerado um pai, por Dean e Sam.

• Fredric Lehne como Azazel: O principal vilão das temporadas iniciais e, até então, considerado o principal problema dos Winchester a resolver. Um Demônio que praticamente matou quase toda a família Winchester, e levou Dean,Sam e John a começarem a se envolver com criaturas sobrenaturais.É também chamado de demônio de olhos amarelos. Mesmo estando morto, indiretamente causará um inferno no relacionamento dos dois.

• Samantha Ferris como Ellen Harvelle: É uma caçadora que administra um bar chamado Roadhouse Harvelle, em Nebraska, que é frequentado por caçadores. Mãe de Joana Harvelle, uma garota bonita e decidida. Ela não suporta a ideia de a filha se tornar caçadora, ainda mais sendo parceira dos irmãos, temendo que aconteça com ela o mesmo que aconteceu com seu marido.

• Alona Tal como Jo Harvelle: É a filha de Ellen Harvelle. Seu pai era um caçador e foi morto durante uma caçada com John Winchester, quando Jo era uma criança. Seu maior desejo é tornar-se uma caçadora como seu pai apesar de sua mãe ser totalmente contra isso. Apesar de ela ter uma "paixonite" por Dean, as circunstâncias nunca permitiram uma aproximação dos dois.

• Katie Cassidy / Genevieve Cortese como Ruby: É um demônio que escapou do inferno pelo portal aberto.Tenta se aproximar de Dean e, principalmente, de Sam, dizendo-se querer ajudá-los. Sam, mais ingênuo, parece acreditar nas boas intenções de Ruby. Porém, Dean, por mais que Ruby, faça coisas, até então fora do comum de acordo com as coisas que demônios fazem, para poder ajudá-los e salvá-los, ele não consegue acreditar nela.

• Lauren Cohan como Bela Talbot: É uma ladra que vende tudo que põe a mão. Não se sabe muito sobre ela, só que fez um pacto com o diabo para que seus pais morressem.Acaba se tornando um transtorno para a vida dos irmãos Winchester.

• Jeffrey Dean Morgan como John Winchester: É o pai dos irmãos Winchester, levava uma vida tranquila como chefe de família até que sua mulher foi assassinada de uma forma estranha e sobrenatural. Desde então, o patriarca não pensa em outra coisa a não ser matar o demônio que tirou a vida de sua esposa. Após um trágico acidente de carro provocado pelo demônio que John até então caçava obssessantemente, vê-se obrigado a fazer um pacto com esse mesmo demônio pela vida de Dean.

• Samantha Smith como Mary Winchester: Esposa de John, e mãe de Dean e Sam.Foi uma caçadora, até que o anjo Miguel apagou grande parte de sua memória(inclusive as memorias dela como caçadora).Foi assassinada por Azazel, no dia em que Sam completava 6 meses.

• Chad Lindberg como Ash: É um antigo morador dos fundos do bar de Ellen, com o seu estilo esquisitão, ele sabe muita coisa sobre computadores. Ajuda muito Dean e Sam durante a 2ª temporada.

• Sterling K. Brown como Gordon Walker: É um caçador assim como Dean e Sam. Porém é ficcionado por vampiros e acredita que não se deve ter piedade desses e dos outros seres sobrenaturais.

• Mark Pellegrino / Jared Padalecki como Lucifer: É o deus do inferno, liberto de sua jaula depois de serem quebrados os 66 selos, vem a terra com planos de se apoderar de seu receptáculo e exterminar toda a raça humana.

• Richard Speight, Jr. como Gabriel: Dado originalmente como apenas um semi-deus, o arcanjo irmão de Miguel, Rafael e Lucifer, deixou o céu por dizer-se estar cansado das brigas dos irmãos. Sam e Dean descobrem que ele era um arcanjo e não apenas um Brincalhão porque, até então, os seus feitos estavam extrapolando os poderes de um simples Brincalhão.

• Julie McNiven como Anna Milton: É um anjo caído que renasceu na Terra. Ela ganhou a habilidade de ouvir as conversas dos anjos após a ressurreição de Dean, e por causa da voz, ela foi internada involuntariamente a uma instituição psiquiátrica com diagnóstico de esquizofrenia. Por de seus poderes, os demônios e anjos têm um grande interesse em ter posse dessa garota.

• Demore Barnes como Rafael: É um dos quatro arcanjos, luta contra Castiel pelos domínios do céu, que até então, estão comprometidos pela 'bagunça' do apocalipse.